Il Museo creato nel 1974 dalla locale Azienda Autonoma di Turismo, è inserito dal 1990 tra i musei diocesani. Rappresenta la prima struttura italiana nata per un "ricovero attivo" di affreschi staccati, sinopie, graffiti, che non fossero ricollocati nei luoghi di provenienza. Si accede al Museo dal Chiostro della Chiesa di San Domenico. Si possono ammirare affreschi staccati, sinopie, graffiti del XIV-XVII sec.. Vi si conservano opere di Niccolò Gerini, Agnolo Gaddi, Paolo Uccello, Il Volterrano. Il Museo ospita provvisoriamente l'esposizione "I Tesori della città" con opere provenienti dal Museo Civico (in restauro) e dal Museo dell'Opera del Duomo. Fra queste, un capolavoro è il Polittico di Giovanni da Milano (1353-1363), proveniente dall'Ospedale della Misericordia. Un altro raffinatissimo esempio di pittura tardogotica è il trittico (1425 circa) di Lorenzo Monaco. Altra opera di notevole interesse è il tabernacolo del Canto al Mercatale di Filippino Lippi, che ridotto in frammenti da un bombardamento nel 1944 è oggi recuperato e ricomposto mostrando lo splendido cromatismo .